结核分枝杆菌利福平耐药的分子机制及检测技术

杨国元'，黄福岚2*，杨彩虹3

(1.民勤县畜禽良种繁育研究中心，甘肃民勤733300;2.凉州区畜牧兽医技术推广中心，甘肃 武威733000;

3.武威市畜牧兽医总站，甘肃武威733000)

摘 要:结核病是一种由结核分枝杆菌引起的人畜共患病,长期以来不仅给人类健康产生巨大威胁,也给养殖场(户)造成巨大的经济损失。利福平作为一个关键性药物,在结核病漫长的治疗历程中发挥了里程牌作用,但随着药物的使用,结核分支杆菌对利福平的耐药性愈发普遍,给结核病治疗带来了挑战。本文对结核分枝杆菌利福平耐药的机制及检测技术做一简单概述,以期为临床上治疗结核病制定合理用药方案提供参考。

关键词:结核分枝杆菌;利福平;耐药;分子机制:耐药检测

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tu-berculosis,MTB)引起的一种人畜共患传染病,传播方式包括呼吸道、消化道和皮肤等,感染动物或者患病病人之间也可通过气溶胶进行传播。人感染后以肺部病理变化为主,典型病例是肺结核,具有高发病率和高致死率的特点,严重者可累及至全身各器官。牛感染以乳房结核、肠结核、肺结核为主。动物感染以后直接扑杀,人感染以后通常使用抗生素(利福平、链霉素、异烟肼等)进行治疗。近年来临床显示,结核分枝杆菌对常用抗生素均产生不同程度的耐药,致使治疗效果不佳或者治疗无效。在治疗过程中用药方案不合理、间断不规则用药、药品质量不佳等均会引起结核分枝杆菌耐药性产生。因此,对结核病的治疗,首先应该了解清楚细菌对拟选择的治疗药物是否耐药,然后制定合理的用药方案,这样才能达到治疗目的。

1 利福平简介

利福平为半合成广谱杀菌剂,发明于 1971年，一度被认为是结核病治疗中最有效的药物之一,具有快速杀菌的作用。当与其他抗结核药物,如霉素、异烟肼联合使用时,杀菌效果更好。研究发现对利福平产生耐药的菌株通常伴随着对异烟肼耐药,因此利福平耐药又被认为是多药耐药(至少同时对利福平和异烟肼耐药)的一个重要标志。

利福平的杀菌机制是通过以非共价键的形式，与结核分枝杆菌rpoB基因编码的DNA依赖性RNA聚合酶β亚基进行特异性结合，首先抑制RNA聚合酶的活性,再抑制RNA 的合成,达到干扰转录起始和RNA延伸的作用，成功阻碍蛋白质的合成,发挥杀菌作用。

2 结核杆菌对利福平耐药的主要机制

关于结核分支杆菌对利福平耐药性的产生,目前理论上认为有两种可能:一是由于rpoB基因突变所致。rpoB基因在结核分枝杆菌基因组中编码的是DNA 依赖性 RNA聚合酶，它只有一个拷贝，含有3534 bp 的开放阅读框，编码1178个氨基酸(aminoacids,AA)。当rpoB基因发生突变以后,RNA聚合酶β亚基会发生突变,影响利福平杀菌作用的正常发挥,从而导致耐药的产生。二是由其他因素引起的耐药。如结核分支杆菌细胞壁渗透性改变引发的耐药,其他未知耐药基因突变引发的耐药,或通过外排泵等机制导致的药物吸收减少产生的耐药。总之,结核分枝杆菌基因组rpoB基因的突变是导致对利福平耐药的主要耐药机制。

据众多研究证实,rpoB基因突变的发生也存在特定规律,即突变的发生位置主要集中在507~533位之间的81个碱基区域内，研究者们将此区域称之为利福平的耐药突变高频区。已有文献报道约且突变主要发生在第531位、526位、516位、511位这4个位点,尤以531位丝氨酸(Ser)的突变率最高,其次为526位组氨酸(His)的突变。通常认为细菌基因突变与细菌的遗传背景与进化压力息息相关,研究者推测,这也许就是结核分枝杆菌利福平耐药rpoB 基因突变存在地区差异性的原因之一。90%~95%的利福平耐药株在rpoB基因的耐药突变区会发生单个核苷酸的突变、缺失和插入突变，

3 结核杆菌对利福平耐药的检测

目前结核杆菌利福平耐药性的检测技术较多，主要分为传统方法和分子生物学方法两大类。传统方法以绝对浓度法、比例法药敏试验为主;分子生物学方法主要以检测特定基因的突变为主。绝大多数结核分枝杆菌利福平耐药株存在rpoB基因特定位点的突变,还有一小部分耐药株未检测到,可能是基因突变发生在rpoB基因耐药决定区之外或者其他相关基因上。尽管如此,通过检测基因突变的方法来判断结核杆菌对利福平的耐药性仍然具有一定的现实意义。

3.1 实时定量PCR(RT-qRCR)溶解曲线技术

实时定量PCR(RT-qRCR)溶解曲线技术的原理是针对耐药基因rpoB的突变位点进行特异性引物设计和扩增,然后做溶解曲线,如果有基因位点发生突变,该菌株的基因扩增产物值与参照菌株相比会发生偏移,通过比较曲线的变化来判断是否存在耐药突变情况。这种方法是在封闭的反应板中进行，特异性非常高,准确率在97%以上,敏感度在80%以上,具有简便、精确、快速的特点,能够减少交叉污染,不足之处是检测费用较高。此外,这种方法也具有局限性,检测不了被检基因外发生突变而引起的耐药。

3.2 实时荧光定量核酸扩增检测技术(XpertMTB/RIF)Xpert MTB/RIF检测技术的原理是用分子信标(Molecularbeacon)技术实时监测半巢式聚合酶链反应扩增产物,实现同时检测结核分枝杆菌和利福平耐药突变。该PCR的目的基因是结核分枝杆菌 RNA聚合酶的活性位点编码区rpoB基因，针对rpoB基因的不同耐药突变位点设计特异性引物、探针,通过检测rpoB基因序列是否存在突变来判断菌株对利福平耐药情况。由于95%以上利福平耐药菌株核苷酸变异发生在rpoB基因耐药决定区，因此该区域核苷酸的突变对耐药性具有很高的预测性。

3.3 分子线性探针杂交技术分子线性探针杂交技术是一种以反向杂交试验为基础,用来检测点突变的技术。该方法检测结核分枝杆菌对利福平耐药性也是通过rpoB 基因的PCR扩增和反向杂交来实现的。该方法的优点是检测速度快,可在2d内给出耐药结核病诊断报告。所以,分子线性探针杂交技术检测诊断耐药结核病具有及时、快速的特点,有助于耐药结核病的早期诊断和快速治疗。

3.4 反向点杂交技术反向点杂交技术的原理是应用生物素标记的引物对利福平耐药基因 rpoB的部分区域片段进行扩增,并设计部分碱基重叠的野生型探针，使耐药突变高发区域的序列完全被覆盖,使之能与结核分枝杆菌野生型菌株的rpoB基因进行杂交。研究证实,反向点杂交技术的灵敏度为91.16%、特异度为98.32%,能实现与DNA测序较为一致的结果。该技术优势主要体现在快速、灵敏、特异性高、操作简便和价格低廉;缺点是存在假阴性的问题。该技术检测耐药基因突变可与测序结果保持一致,因此其适用于结核分枝杆菌临床分离株对利福平耐药性的检测,并且作为基因芯片的技术基础,具有广阔的应用前景。

3.5基因芯片技术基因芯片技术的原理是应用已知的核酸序列作为探针,通过与互补的靶序列进行杂交，再通过检测杂交信号的方式来达到定量与定性分析的一项技术。该方法可将多种探针固定在基片上，然后再与待测样本DNA 或RNA进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交信号的强度来获得样品分子量和序列信息。与传统杂交方法相比，该技术从样品制备到出检测结果,全程只需4h,具有快速、精准的优势;缺点是芯片制备复杂,检测所需仪器价格昂贵,花费成本高,在临床上不能广泛应用。。

3.6 限制性内切酶片断长度多态性(RFLP)技术限制性内切酶片断长度多态性(RFLP)基本原理是利用菌株基因突变引起酶切位点的变化,从而导致酶切片段发生变化。当用限制性内切酶酶切耐药相关基因时,如果耐药相关基因存在突变,则该基因酶切产生的酶切片断会与理论片段产生差异，经琼脂糖凝胶电泳以后与标准酶切片断进行分析比对，即可检测出耐药突变。

3.7 扩增受阻突变体系技术(ARMS-PCR)ARMS-PCR 是结合ARMS-PCR、GeXP多重基因表达遗传分析系统和TSP技术相结合而产生的一种检测技术。在已知突变位点等位基因相应引物的上游加入TAG碱基,PCR过程中选择性的扩增突变型与野生型的基因,通过通用引物扩增得到的特异性扩增产物,通过产物大小和电泳图中片段的有无,来判断基因突变是否发生以及发生的位置。3.8膜反向斑点杂交技术膜反向斑点杂交技术是一种建立在PCR基础上的反向杂交方法,原理是应用生物素修饰的特异引物扩增DNA，使PCR产物带有生物素标记,将PCR产物变性后与固定在膜上的特异寡核苷酸探针杂交,通过观察斑点杂交信号强弱来判读结果。

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